微生物组+转录组联合研究揭示治疗艰难梭菌感染的新机制 | 微生物专题

论文标题：New Host-Directed Therapeutics for the Treatment of Clostridioides difficile Infection

刊登时间：2020年3月

发表杂志：mBio

影响因子：6.747

研究机构：德克萨斯大学医学院微生物学与免疫学系

技术手段：16S rRNA测序和转录组测序

关键词: 艰难梭菌；小鼠感染模型；宿主导向疗法；作用机制；微生物群

1研究背景艰难梭菌是一种革兰阳性、专性厌氧的梭状芽孢杆菌，频繁和过量使用抗生素会使患者容易感染艰难梭菌感染（CDI），从而导致致命的伪膜性肠炎。即使采用有效疗法，CDI的复发率也极高。频繁的复发不仅使病人虚弱和降低生活质量，而且还会增加死亡率和医疗费用。目前治疗CDI的方法很少。广泛使用的万古霉素或非达索霉素治疗虽然在大多数情况下是有效的，但在世界范围内已经出现了具有耐药性或对抗生素敏感性降低的艰难梭菌分离株。此外，抗生素治疗的有效性也会随着每次复发而下降。因此，需要发现和开发用于治疗艰难梭菌感染的新的治疗方案。药物再利用或重新定位是一种已被证明能有效确定各种人类疾病新疗法的策略。先前利用这种方法确定了三种经美国食品和药物管理局批准的非抗生素药物，阿莫沙平（AXPN；一种抗抑郁药）、多沙普仑（DXP；一种呼吸兴奋剂）和三氟拉嗪（TFP；一种抗精神病药），它们为小鼠提供了针对多种致病菌（包括艰难梭菌）的致死性感染的显著保护作用。但是，这些药物的作用机理尚不清楚。本研究确定了致死性艰难梭菌感染的小鼠模型中导致药物功效的机制，从而加深了我们对这些药物在传染病发病机理中的作用的认识，这些疾病以宿主对艰难梭菌的免疫反应为中心。总的来说，这些研究强调先天免疫反应的关键作用以及免疫调节作为对抗CDI的潜在治疗选择的重要性。
2研究方法2.1 实验材料艰难梭菌VPI 10463（ATCC 43255）；在无病原体条件下饲养至成年的C57BL/6小鼠和无菌（GF）C57BL/6小鼠；抗生素混合物（粘菌素、庆大霉素、卡那霉素、甲硝唑和万古霉素）；克林霉素；先导药物（TFP，AXPN和DXP）2.2 实验设计图12.3 数据处理2.3.1 DNA提取及艰难梭菌和毒素的定量提取小鼠盲肠内容物样本中的总基因组DNA，然后进行定量PCR来测定小鼠盲肠内容物样本中的艰难梭菌16S rRNA基因拷贝数相对于细菌16S rRNA基因拷贝总数的数量。用酶联免疫吸附法（ELISA）测定艰难梭菌毒素A和B的含量。2.3.2 16S rRNA基因测序和微生物组分析对16S rRNA基因的V4区进行扩增和测序，使用QIIME v1.8评估细菌多样性和群落组成，使用RDP分类算法和SILVA参考数据库（v123）完成每个OTU代表序列的分类分配。2.3.3 转录组测序及RNA-seq数据的确认从盲肠组织中提取总RNA进行RNA序列分析,并进一步用实时定量PCR（qRT-PCR）测量mRNA表达以及确定所选的RNA测序数据。
3研究结果3.1 先导药物可保护小鼠免受致命的艰难梭菌感染。作者最近的一项研究表明将亚临床剂量的万古霉素与先导药物AXPN、DXP和TFP联合作为辅助治疗（感染后24小时）可将致死率降低80%至100%。虽然TFP单独发挥60%的保护作用，但并没有确定AXPN和DXP单独的治疗效果。为了验证之前的研究结果，并评估每种先导药物的治疗效果，成年C57BL/6小鼠接受抗生素预处理，然后给予致死剂量（105个孢子灌胃）的艰难梭菌，然后进行药物治疗。结果表明，这三种药物都对致命艰难梭菌感染都提供了显著的保护，AXPN提供了70%，DXP 50%，TFP 55%的保护（图2B）。起初，符合暴发性疾病的特征，药物治疗组小鼠的临床评分较低，体重减轻，在感染后第3天，药物治疗组和对照组（磷酸盐缓冲液[PBS]）出现显著差异（图2C和2D）。第3天后，对照组中的小鼠普遍死亡，而药物治疗组中存活小鼠的临床评分和体重恢复到基线值（图2B至2D）。同样，与PBS处理的小鼠相比，所有药物治疗组的艰难梭菌毒素A和B的毒素水平显著降低（图2F和2G）。由此可见，先导药物通过限制艰难梭菌的生长和毒素的产生来介导保护作用。图23.2 先导药物通过宿主导向的机制提供保护在确定每种药物单独提供针对CDI的保护后，接下来继续进行研究以阐明其潜在作用机制。首先，为了确定药物是否具有抗菌特性，在每种药物以33 μM浓度存在的情况下培养艰难梭菌，与阳性对照万古霉素处理组相比，三种药物均未表现出杀菌活性。结果表明，药物介导的CDI保护不是由于体内细菌的杀灭所致。然后，进一步评估了药物是否直接影响艰难梭菌的主要毒力因子（毒素A和B）的产生。与观察到的细菌生长情况相似，没有一种药物直接影响毒素A或B的产生。总的来说，这些结果表明，尽管药物治疗可减少体内细菌负担和毒素产生，保护作用不是通过病原体的直接相互作用来实现的，而是通过对宿主的间接影响来实现的。3.3 先导药物不能恢复保护性微生物群落通过对小鼠盲肠内容物中提取的DNA进行16S rRNA基因序列分析来确定先导药物是否影响了小鼠暴露于抗生素和CDI引起的微生物群落变化。与以前的研究一致，与未接触过抗生素的动物相比，单独使用抗生素（ABX）导致微生物组多样性显著降低。感染30小时后，与未经药物治疗的小鼠相比，无论药物治疗情况如何，多样性仍然受到限制(图3A)。主成分分析（PCA）（图3B）评估了各个小鼠之间的总体组成差异，表明抗生素预处理后微生物群的组成发生了明显变化，在感染过程中这些变化仍保持相似。就多样性而言，药物治疗对微生物组成的影响很小，这类似于经PBS处理的小鼠的微生物组成（图2B）。总体而言，在感染组中未观察到较多类群的显著变化（图3C），这表明AXPN、DXP或TFP治疗没有介导与CDI保护相关的微生物群落变化。图33.4 微生物群是先导药物有效性的必要条件为了确定微生物群是否有助于药物介导的对致命CDI的防护，无菌（GF）小鼠感染低剂量的艰难梭菌（104个孢子），并在感染时施用先导药物或PBS（图1B）。与CDI模型（图2B）的结果形成鲜明对比，GF小鼠经药物治疗后体重减轻或临床评分均无明显改善，均死于感染（图4B至D）。同样也没有证据表明GF小鼠体内的细菌清除率、各组间的艰难梭菌负担和毒素滴度相当（图4E至G）。这些研究表明先导药物不会直接影响艰难梭菌的生长或毒素的产生，但与宿主微生物组介导的保护作用密切相关。图4
3.5 先导药物可以促进诱导性先天性宿主防御为了确定哪些防御机制和网络可能与药物介导的保护有关，进行了转录组测序分析，以获取CDI模型中盲肠反应的全基因组表达谱。结果表明，每种药物都会诱导一个独特的表达谱，与未经处理的对照组相比，一组或多组中的5,894个转录本被改变了4倍（图5A）。药物治疗促进或增强了许多编码具有不同功能产物的基因的诱导（图5B），包括具有细胞内和细胞外抗菌功能的钙结合蛋白（S100a8和S100a9）、用于组建中性粒细胞和单核细胞（Ccl3、Ccl4、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl5）的趋化因子、参与启动和促进免疫或感染的蛋白质（Nlrp3、Il1a、Il33和Il22）以及其他具有抗菌活性的因子（Nos2、Lcn2、Reg3b和Reg3g）。与PBS处理组相比，药物处理产生的宿主转录本中有4,557个（12.1％）差异表达（倍数变化大于4）（图5C）。尽管每种药物都能诱导独特的表达谱，但三种药物之间共有773个转录本的变化（图5C）。为了证实RNA序列分析，通过实时定量PCR测量了20个选择基因的mRNA表达水平，其中包括几种编码趋化因子的基因，包括IL-22和IL-33（图5F），这些基因已通过进行ELISA和多重免疫测定以确定蛋白质水平而得到验证。图53.6 AXPN增强先天免疫途径依赖于微观生物群落就动物存活而言，AXPN是最有效的药物，与PBS处理的小鼠相比，其基因表达差异最大(图2B和5C)，因此作者作者致力于进一步阐明该药物在实验性CDI中的作用机制。通过qRT-PCR分析，证实了AXPN显著增强参与免疫保护的几个基因的表达（Il33、Il22、Reg3b、Reg3g）和中性粒细胞募集（Cxcl1和Cxcl2）(图6A)。重要的是，与PBS治疗组相比，AXPN治疗组中一些先前被认为对CDI结果有不利影响的促凋亡细胞因子（Il1b, Il6, Il23和Tnfa）的mRNA表达下调(图6A)。通过比较CDI和GF小鼠模型（图1A和图1B）感染30 h后的mRNA表达谱，发现在GF小鼠中AXPN介导的反应发生了显著改变，在没有微生物群的情况下，AXPN处理对Il33、Il22和Reg3g的mRNA表达的上调并不明显，而Il1b、Il6和Tnfa的表达则得到了促进，且治疗组之间没有差异（图6B和6C）。综上所述，AXPN增强了致命CDI期间的早期抗菌防御，并需要微生物衍生因子来激发保护作用。图6
3.7 IL-33是AXPN介导的抗致死性CDI保护所必需的检测感染和给药过程中不同时间点细胞因子的表达以确定IL-33是否参与AXPN介导的保护作用。在PBS处理组中，Il33的mRNA表达在感染1天后上升（增加24倍），并在第3天保持增长。然而，注射AXPN显著增强了这种反应，感染1天后诱导率最高达到90倍，随后逐渐降低至PBS对照组的水平（图7A），这与在蛋白质水平上观察到的效果相似（图7B）。为了确定IL-33在针对致死性CDI的药物保护中的重要性，向AXPN治疗的小鼠施用了抗IL-33中和抗体或对照抗体。在AXPN治疗期间，通过中和抗IL-33抗体阻断IL-33降低了存活率（图7C），显著增加了艰难梭菌负担（图7D），毒素水平升高（图7E和7F）。有趣的是，抗IL-33抗体治疗对中性粒细胞的招募也有显著影响。组织学分析显示，用抗IL-33抗体和AXPN治疗的小鼠肠固有层中的中性粒细胞比用对照抗体和AXPN治疗的小鼠少（图7G）。总之，这些结果表明IL-33是AXPN效应的一个关键效应因子，可能通过增强中性粒细胞募集来清除病原体。图7
3.8 中性粒细胞对AXPN介导的艰难梭菌清除和IL-33诱导至关重要大量研究表明，中性粒细胞炎症是艰难梭菌相关疾病的标志，而中性粒细胞的耗竭往往会增加感染模型中的死亡率。鉴于在AXPN给药后观察到嗜中性粒细胞计数增加，并且抗IL-33抗体治疗使嗜中性粒细胞计数减少（图7G），由此评估了嗜中性粒细胞在AXPN效力中的作用。在PBS处理的小鼠中，嗜中性粒细胞的耗竭导致艰难梭菌的负担和毒素滴度的适度增加（图8A至8C）。令人惊讶的是，AXPN治疗并不能消除嗜中性白细胞减少的影响，艰难梭菌的负担和毒素滴度等于或大于PBS处理的对照组中观察到的浓度，这表明CDI的严重程度有所降低（图8A至8C）。在缺乏嗜中性粒细胞的情况下，AXPN未能诱导Il33表达或显著降低促凋亡细胞因子基因Tnfa和Il6的表达（8D），这表明AXPN对致命CDI的保护取决于嗜中性粒细胞促进IL-33产生的作用。图8
4小结这项研究扩展了先前关于AXPN、DXP和TFP作为有效对抗革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌病原体的药物的研究。这项工作也促进了我们对艰难梭菌的宿主免疫反应的理解，揭示白细胞介素-33反应性中性粒细胞在清除病原体和减少毒素中的潜在作用。尽管这些药物不是同一类，但这三种药物都作用于中枢神经系统。这三种药物是否可能通过共同的神经免疫信号共享保护机制尚有待确定，值得进一步研究。最后，本研究中，使用低于人类治疗剂量的剂量在小鼠中实现了药物的临床有效性。这是十分重要的，因为它表明按人体测验定标的剂量是有效的，并将限制药物的潜在副作用。相关阅读微生物16S测序数据的正确打开方式
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